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    蛋白保存方法,你知道多少

    更新時(shí)間:2022-05-24      點(diǎn)擊次數:5439
      生物大分子的貯藏保存可分為干態(tài)和液態(tài)貯藏兩種。蛋白質(zhì)失活受多種理化因素的影響,主要有空氣、溫度、水分、光線(xiàn)、酸堿度、樣品狀態(tài)、微生物活動(dòng)、保存時(shí)間和容器等。這些因素可單獨起作用,但更多情況是協(xié)同作用??偟膩?lái)說(shuō),蛋白質(zhì)的保存主要考慮其構型穩定、活性中心的保護、避免輔助因子喪失等,以防止其變性、解聚或降解。由于溫度和水分對蛋白質(zhì)的穩定性影響很大,故蛋白質(zhì)最好是低溫、冷凍或冷凍干燥后低溫干燥保存。
     
      1. 液態(tài)保存
     
      (1).在低溫下保存 蛋白質(zhì)對熱敏感,溫度越高,穩定性越差。因此,低溫保存蛋白質(zhì)溶液在絕大多數情況下是有利的。一般蛋白質(zhì)越純,其穩定性越差。特別是純酶溶液,對熱很不穩定(少數酶例外,如核糖酸酶能短期煮沸,胰蛋白酶能在稀HCl中耐90℃,及某些高溫細菌產(chǎn)生的耐熱性酶等),多數在35℃一40℃以上就會(huì )失活,難以長(cháng)期保存,在普通冰箱中通常也只能保存一周左右。因此,液態(tài)蛋白質(zhì)樣品常常在—5℃~—10℃以至—20℃以下冰凍保存比較理想,有時(shí)經(jīng)數月或數年仍保留大部分活性。
     
      但是,各種蛋白質(zhì)的耐熱性不同,并非溫度越低.穩定性越好。羧肽酶、脂蛋白和某些抗體經(jīng)冰凍再融解,即*變性破壞。但某些酶經(jīng)凍融后,活性反而增加,這可能是由于酶顆粒結構松散,表面積增大,暴露出更多活性基團的緣故。反復冰凍和融化一船會(huì )導致蛋白質(zhì)變性.應盡量避免。為了防止凍融損傷,冰凍保存要求樣品濃度大、體積小、表面積大、含鹽低、凍結迅速、—70℃以下保存、用時(shí)迅速融化等。
     
      (2).在穩定PH下保存 多數蛋白質(zhì)只有在很狹窄的pH范圍內才穩定.超出此范圍即迅速變性。如鯨肌紅蛋白在等電點(diǎn)PH6.8附近時(shí)穩定,卵類(lèi)粘蛋白在中、酸性條件下對熱 穩定。蛋白質(zhì)穩定存在的PH一般是等電點(diǎn)。因此,酸性、中性和堿性蛋白酶酌穩定pH分別為PH2~PH6、PH6~PH9和PH5~PH10.5。但也有例外,如血漿蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)PH4.6,而其穩定pH為6.8,穩定PH與其等電點(diǎn)并不相同。酶的穩定PH也并非是酶反應的最適PH,二者有時(shí)可相差l至數個(gè)pH單位。所以保存液態(tài)蛋白質(zhì)樣品時(shí),應小心調到其穩定PH范圍內。
     
      (3).在高濃度下保存 液態(tài)蛋白質(zhì)易受水化作用影響,保存時(shí)濃度不能太稀(如1毫克/毫升以下),否則將可能引起亞基解離、表面變性或器壁吸咐。一般蛋白質(zhì)在濃溶液中比較穩定,中間樣品的保存可采用濕法沉淀。需要保存酶溶液時(shí),其蛋白質(zhì)濃度也應大于1%。保存時(shí)間較長(cháng)時(shí),還需加入防腐劑、蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)或其它穩定劑。如免疫球蛋白可加 0.04%疊氮鈉,-20℃下凍存。蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)的選擇:中性蛋白酶常用EDTA,堿性蛋白酶用二異丙基氟磷酸(DFP)、苯甲基璜酰氟(PMSF),酸性蛋白酶用十二烷基磺酸鈉(SDS)、N —溴琥珀酰亞胺?;钚灾行臑榻z氨酸的蛋白面加二異丙基氟磷酸,活性中心為巰基的蛋白酶加對氯汞苯甲酸等。但某些抑制劑(如DFP、PMSF)不僅抑制蛋白酶,對其它酶可能也有抑制作用,使用時(shí)應慎重。
     
      (4).在保護劑存在下保存 很早就有人觀(guān)察到,在無(wú)菌條件下,室溫保存了四十五年的血液,血紅蛋白僅有少量改變,許多酶仍保留部分活性。另一方面,有些純酶濃即使冷卻也很不穩定,保存期僅為幾小時(shí)或幾天。上述兩種現象的原因是血液中含有某些使蛋白質(zhì)穩定的因家,而純酶則缺乏這些穩定因素。為了較長(cháng)期保存蛋白質(zhì)溶液(特別是敏感的純酶 或稀蛋白溶液),常常加入某些穩定劑進(jìn)行保護。多數蛋白質(zhì)只有在疏水環(huán)境才能長(cháng)期保存。加入某些物質(zhì)可以降低溶液的極性,避免蛋白質(zhì)變性失活。一些蛋白質(zhì)在高離子強度(1mol/L~4mol/L或飽和鹽液)的極性環(huán)境下保持活性,中性鹽可穩定這類(lèi)蛋白質(zhì)。 一些蛋白質(zhì)表面或內部含有半胱氨酸巰基,易被空氣中的氧緩慢氧化為次磺酸或二硫化物,使蛋白質(zhì)因電荷或(和)形狀發(fā)生改變而失活。保存時(shí)可加人巰基試劑,使蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài),并隔絕空氣(甚至真空或惰氣中)密閉保存。
     
      2.固態(tài)保存
     
      (1).制成干粉或結晶 固態(tài)蛋白質(zhì)比液態(tài)穩定。一般蛋白質(zhì)含水量超過(guò)10%時(shí),無(wú)論在室溫或低溫均容易失活;含水量若降低至5%時(shí).在室溫或冰箱中均比較穩定,但在37℃活性則明顯下降。低含水量對微生物和化學(xué)活性不利,一般認為,微生物活性在含水量10%以下、化學(xué)活性在3%以下即被抑制。長(cháng)期保存蛋白質(zhì)的最好辦法是把它們制成結晶或干粉(現多采用冷凍干燥)。
     
      (2).制成水不溶酶 在多數情況下,酶經(jīng)固定化后,對酸、堿、蛋白酶、溫度等穩定性提高,更易于保存。
     
      (3).制成酶衍生物 這也能提高某些酶的穩定性。 總的來(lái)說(shuō),蛋白質(zhì)的保存主要考慮其構型穩定、活性中心的保護、避免輔助因子喪失等,以防止其變性、解聚或降解。由于溫度和水分對蛋白質(zhì)的穩定性影響很大,故蛋白質(zhì)最好是低溫、冷凍或冷凍干燥后低溫干燥保存。
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